水蛭素与凝血酶的亲和力极强，1ug水蛭素可中和5ug凝血酶，相应摩尔比为1：1，即中和一个国际单位(NIH单位)的凝血酶需要一个抗凝单位(IAT—u)的水蛭素。根据以上摩尔比，以水蛭素含量为指标，对不同浓度、温度及提取时问的水蛭提取物进行比较，选择最佳工艺路线，并确定水蛭提取制备工艺。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 仪器SIGMA单道移液器；RE一52A型旋转蒸发器(上海亚荣公司)；Sigma 4K15高温冷冻离心机；自动酸碱滴定仪DL53Mettler Toledo Switzer—land。

1．1．2 药物与试剂 水蛭购于北京松兰中药饮片有限公司，经北京松兰中药饮片公司主任中药师蔡长德鉴定为水蛭科动物蚂蟥干燥全体；纤维蛋白原(Fibrinogen)：SIGMA；凝血酶(Thrombin)：SIGMA。

1．2 实验方法

1．2．1 水蛭素的测定方法取纤维蛋白原0.25 g，溶于50 ml的Tris—HC1缓冲液(pH-8)中，得0.5％ 的纤维蛋白原溶液。稀释凝血酶到5 NIH／ml。取0.2 ml纤维蛋白原溶液，加入20ul水蛭素提取液，并加入凝血酶至凝固，得水蛭素含量=(凝血酶浓度×凝血酶用量)／水蛭素提取液体积。

1．2．2 乙醇浓度的选择称取水蛭粗粉10 g，分别用不同浓度的乙醇进行提取，乙醇的含量为0%，30％ ，50％ ，70％ ，90％ ，提取温度定为60℃ ，提取时间1.5 h，过滤，回收乙醇，样品定容为25 ml。分别测定样品中水蛭素含量。水蛭素的测定可依据其与凝血酶按1：1结合的原理，采用以上方法测得。

1．2．3 温度条件的选择  由于水蛭素只能在80℃下稳定存在15 min，所以在选取温度时，应尽量避免温度过高造成水蛭素失活。所以本实验选用在50OC，60OC=，70OC下分别进行。称取水蛭粗粉10 g，采用70％的乙醇于3个温度各提取1.5 h，并采用同样的方法测定水蛭素含量。

1．2．4 提取时间的选择  称取水蛭粗粉10 g，用70％ 的乙醇，在60OC下分别提取1 h，1.5 h，2 h。分别测定提取样品的水蛭素含量。

表1    不同浓度乙醇的提取结果

乙醇浓度(%)                         水蛭素含量(IAT-u/ml)

0                                       0.412

30                                      0.635

50                                      0.809

70                                      2.136

80                                      2.369

2．1 乙醇浓度的选择  从表1的数据可以看出，不同浓度的乙醇对水蛭的提取效果有较大的影响。从水蛭素的含量来看，随乙醇浓度的提高，其含量不断增加，在70％ -80％ 的乙醇浓度下，获得较好的提取效果。由于水蛭素是一种可溶于水和乙醇等有机溶剂的蛋白质，所以综合两种因素考虑，70％ ～80％的乙醇浓度是较好的提取浓度。

 2.2提取温度的选择  见表2

表2   不同温度的提取结果

提取温度（0C）                      水蛭素含量（IAT-u/ml）

50                                        1.881

60                                        2.105

70                                        2.156

2.3 提取时间的选择   见表3

表3 不同提取时间的提取结果

提取时间（h）                      水蛭素含量（IAT-u/ml）

1                                       1.819

1.5                                     2.130

2                                       2.165

3 小结

本实验过程利用了水蛭素和凝血酶1：1的配比关系，测定不同条件水蛭提取液的水蛭素含量，确定了水蛭工业提取的最佳条件。实验结果表明，乙醇浓度在70％ 一80％ 之间，温度在60OC左右，提取时间1.5 h会达到较好的提取效果。

金康道夫科技集团（香港）有限公司致力于发展集养殖、研发、生产、销售及服务为一体的天然水蛭素产业链，主打产品：水蛭素、血管清道夫、天然活性多肽。金康道夫不断研发和丰富水蛭素产品线，以让天下人血管通畅健康长寿为己任，为大众提供健康全程管理与服务。目前，公司产品已远销加拿大、泰国、新加坡、马来西亚及台湾等二十多个国家和地区。